흥분성 신경전달물질의 수송체와 수용체의 구조 및 작용 메카니즘에 관한 연구
Structure and molecular mechanism of the excitatory neurotransmitter transporters and receptors
글루타메이트는 신경전달물질로서의 역할 뿐만 아니라 신경세포의 발달 과정에서도 중요한 역할을 합니다. 최근에는 시냅스에서 글루타메이트 농도 조절에 관여하는 수송체나 신호전달을 매개하는 수용체들이 각종 뇌신경질환과 직접적인 관련이 있다는 연구결과가 수차례 발표되면서 바이오의약품 개발 프로그램의 가장 주요한 표적이 되고 있습니다. 하지만 이들에 관한 생화학적 데이터가 수집된 것은 최근 몇 년에 불과해, 정확한 작용 기작에 대해서는 여전히 가설 수준에 머무르고 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 본 연구실은 포유 동물의 글루타메이트 수송체 (VGLUT, EAAT, System Xc-) 및 수용체 (metabotropic receptor)의 고해상도 구조를 X-선 결정학 방법으로 규명할 뿐만 아니라 생화학적인 접근을 통한 기능 연구를 병행하여 흥분성 신호전달의 작용 메카니즘을 분자 수준에서 밝히고자 합니다.
세포막 단백질 구조연구에서 가장 중요한 핵심기술은 다양한 유전자 라이브러리를 확보하고, 단백질을 과량 발현할 수 있는 유전자를 빠른 시간 안에 스크리닝 하는 것이다. 이를 위해 인간 뿐만 아니라 이와 아미노산 서열이 유사한 고등생물의 타겟 유전자를 확보하여 발현 테스트를 진행한다. 단백질 발현테스트는 GFP(Green Fluorescence Protein)-융합 방법을 이용하여 형광의 관찰 유무에 따라 단백질의 발현 여부를 쉽게 확인할 수 있는 스크리닝 방법을 이용한다.
뿐만 아니라 GFP-융합방법을 이용하면 타겟 단백질을 세포막으로부터 추출하는데 효과적인 detergent 스크리닝 역시 용이하다. 형광을 감지할 수 있는 HPLC 장비를 이용하면 소량의 단백질로도 detergent에 따른 단백질의 구조변화 및 안정성을 쉽게 모니터 할 수 있다. 단백질 정제에 적합한 detergent 선택이 끝나면 여러 정제 방법을 거쳐 순도가 높은 단백질을 확보한다.
글루타메이트를 매개로 하는 흥분성 신호전달의 활성화 메카니즘을 이해하기 위해서는 구조-기능의 상관 관계에 대한 연구가 병행되어야 한다. 이러한 기능 연구는 타겟 단백질의 생화학적인 특징을 분자수준에서 규명하는데 필수적이다. 뿐만 아니라 막단백질들이 세포막으로부터 분리되면 고유의 기능을 잃어버리는 경우가 많은데 이러한 in vivo 혹은 in vitro 상에서의 기능 확인 실험은 구조 연구에 쓰이는 타겟단백질이 활성을 유지하는지 검증하는 중요한 과정이기도 하다. 이를 위해 생체막과 유사한 성분과 구조를 갖고 있는 리포좀(liposome)이나 nanodisc에 타겟 단백질을 삽입하여 연구에 이용할 계획이다.
지질이중막으로 구성된 리포좀의 내부 공간에는 이온이나 리간드들이 축적될 수 있기 때문에, 이를 이용하면 타겟 단백질의 글루타메이트 수송 여부 및 흥분성 신호전달을 위해 이온 결합과 이동이 세포막 내외로 어떻게 일어나는지에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한 여러 선행연구에서 VGLUT의 글루타메이트 수송능력에 핵심적인 역할을 수행하는 아미노산 잔기가 확인되었는데 이들의 중요성을 분자수준에서 확인하기 위해 여러 돌연변이(mutant)들을 제작하여 정상 단백질과의 비교를 통해 구조 및 기능의 차이를 규명하고자 한다.
고해상도 구조를 얻기 위해서는 X-선의 강한 에너지를 견딜 수 있는 단백질 결정을 만들어야 한다. 전통적인 vapor diffusion 방식을 통한 결정화 방법 외에도 생체막과 유사한 환경을 제공하여 막단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 새로운 결정화 방법인 Bicelle과 Lipidic Cubic Phase 방법도 테스트 한다.
타겟 단백질의 활성을 억제하거나 향상시킬 수 있는 신약후보물질과 결합한 단백질의 고해상도 구조는 이들의 결합 방법 및 특성에 관한 중요한 정보를 제공할 것이다. 이러한 정보를 기반으로 보다 강한 결합력(affinity)과 특이성(specificity)을 갖는 신경질환 치료후보물질을 디자인할 수 있도록 단서를 제공하여 새로운 의약품 개발을 시도해 보고자 한다.
